现进行优惠促销，欢迎来电洽谈。免费赠送3个读码框处理，以确保蛋白可以正常表达。

可以选择增加提供转化到酵母的文库，可以提供足够100次筛选的酵母转化菌液文库，同时还会提供质粒文库。

可选均一化处理，可以有效提高低丰度基因筛选检出率。

服务时间：25个工作日内 

服务报价：

我们拥有多年的文库构建经验，已完成数千个各类文库构建，我们构建文库的成功率为98%以上。 

一、产品介绍:：

 我们可以提供基于invitrogen的gateway方法的文库构建系统，该系统具有以下优点：

       1）我们从mRNA为模板直接进行cDNA双链的合成，没有经过任何扩增的过程,保证了文库的质量和忠实性. 

       2）使用目前市场上高质量的反转录酶，保证文库的片段长度和全长率，普通文库的全长率会在50%以上。       

       3）使用gateway高效率的片段和载体重组连接方法，连接效率很高，可以大大提高原始文库的库容量（可以达到1*10^7 CFU 以上的原始文库库容量）。 

       4）该系统的文库会有初级文库提供，初级文库的载体为pDONR221，可以方便地将该样本的文库再构建到其他任意载体上，形成其他用途的文库，比如：pPR3-N、PET22b、PET19b、pYD1、pPRC9K、pLenti6.3、pET32b、pDest52、pDEST17等任意载体。

 但该方法相对于我们的All-Direct系统也有一些缺点：

        1.由于Gateway系统的重组臂是变化的，而且attL重组臂里带有终止密码子，且这个重组臂有100多个碱基，很长，为了减少重组臂对蛋白表达的影响，不得不经过2次重组，以让最终文库的载体里不会带有attL重组臂，但还是会引入一个20多个碱基的attB重组臂，对表达或多或少还是有一点影响。

        2.由于必须经过2步重组，就需要进行初级文库的转化，摇菌扩增，质粒提取过程，而摇菌过程类似于PCR扩增的过程，是一个快速扩增的过程，这个过程中会存在基因之间的竞争性抑制效应，会造成高丰度的基因占的比例越来越多，低丰度的比例越来越少甚至丢失，而很多公司采用液体培养的方式，更加大大的增加了这个丢失效应，据我们的多年经验数据，每经过一次扩增和质粒提取过程，高丰度的基因与低丰度的基因拷贝数差异会扩大20倍以上，文库的平均插入片段会降低200bp左右。如果之前有做均一化处理，这一步的扩增，就基本会抵消均一化的作用。我们公司降低消除摇菌扩增的影响，做了一些技术上的改进，但还是会有一些影响的。

我们公司有另外一套All-direct系统的文库构建，相对于gateway方法，优点是避免了一次初级库的构建和菌液扩增以及质粒提取步骤，可以避免gateway方法的一些缺点，且重组效率等指标与gateway方法一致。缺点是，infusion方法不太适合一个样本一次的RNA分离和cDNA合成，同时构建到3个以上的载体上，可以一次同时构建到1-3个载体，形成1-3个文库，对于绝大多数情况，并不需要将一个样本构建到多个文库载体上，这个足够满足需要了。

二、实验步骤

2.1.RNA提取 

2.2.mRNA分离 

2.3.cDNA合成（使用酶促法直接合成，不经过PCR扩增过程，比SMART方法质量大大提高） 

2.4.cDNA长度分级（和均一化处理）

2.5.分级后的cDNA与pDONR221载体进行gateway BP重组，形成初级文库。

2.6 初级文库的电转化和涂板培养。

2.7 初级文库检测。

2.8 初级文库铺板扩增和质粒提取。

2.9 初级文库质粒与酵母文库载体pGADT7（pGADT7-Rec2)进行gateway LR重组，形成次级文库。

2.10 次级文库的电转化和涂板培养。

2.11 次级文库检测。

2.12 次级文库铺板扩增和质粒提取。

2.13 包装和发货

三、产品内容 

    1）初级文库的甘油菌液（含20%甘油的LB培养基）

      2）酵母文库的甘油菌液（含20%甘油的LB培养基）

      3）初级文库质粒

      4）酵母文库质粒，

      5）随机克隆子的PCR鉴定图谱

      6）文库构建报告。

四、质量标准   （初级文库和次级文库指标相同）

      3.1 文库库容量：大于1*10^7CFU。

      3.2 平均插入片段：大于0.8-1Kbp。

      3.3 阳性率：大于95%。  

五、服务时间

      25个工作日内

      如需转化酵母延长15个工作日。 

六、材料要求:

 客户构建指定的酵母双杂交cDNA文库，由客户提供组织、细胞或总RNA给我们即可：

 细胞样本：细胞数量大于1*10^7 
 动物样本：大于1g 
 植物样本：大于2g 
 总RNA：大于500ug 

七、客户案例:

       目前我们已经成功完成数千个不同样本的文库构建，主要客户为中国科学院上海植物生理生态研究所、上海交通大学、浙江大学、浙江省农科院、山东省农科院等多家单位完成酵母双（单）杂交文库构建服务，物种包括人、小鼠、大鼠、水稻、拟南芥、牡丹、稻飞虱、苹果、油菜、小麦、贝壳、葡萄、真菌等。

八、文库筛选:

       我们是国内极少数能同时提供文库构建和文库筛选的公司，对于酵母双杂交筛选服务，您只需要提供诱饵基因序列即可，我们会进行以下工作，筛选的报价为3万元整:

     1.诱饵载体的测序验证以及构建到双杂交筛选载体上
     2.诱饵基因的自激活检测，检测通过后继续下一步实验。
     3.诱饵质粒转化酵母细胞，验证合格后再转化文库质粒
     4.酵母筛选和3AT条件优化
     5.筛选结果的测序
     6.筛选结果的回转验证
     7.筛选结果递交:包括筛选报告，筛选结果的测序结果和blast结果，筛选结果克隆的质粒实物。

九、FAQ:

9.1. 如何选择合适的文库构建方法进行建库？

      我们是市场上可以同时提供3种文库构建方法的公司，这也足以看出我们公司的技术实力。
3种方法的比较如下：

      1) Clonetech 的SMART方法，该方法基本是被淘汰的，我们上文有详细的技术比较，其好处就是RNA的起始量可以很小，一般只需要几ug即可，该方法成本很低，一般不建议选择。

      2) Invitrogen的方法，该方法质量上较SMART方法要好很多，其对试剂的质量要求也很高，需要全部使用invitrogen的原厂试剂。我们全部使用invitrogen公司试剂进行构建，且做了一些技术改进，提高了文库质量。该方法对起始的RNA要求较高，建议起始用量是大于200ug。但该方法有一个严重的缺点，就是需要进行两次重组才能得到酵母文库，而多一次重组就会多一次文库扩增过程，会严重影响文库质量。在上文中有详细的技术比较和介绍。
       别的使用该方法建库的公司，只能使用商业化的试剂盒构建文库，没有做任何改进。且由于进货渠道的原因，试剂盒内的有些试剂他们是买不到的，质量就会大打折扣。比如DH10B 电转化感受态细胞，这个感受态细胞转化效率比国产的高出100倍以上。这个感受态细胞需要具有一堆的海关批文才能买到，其他公司由于没有相关资质，是无法进口的，据我们了解，国内某公司居然会用化学转化细胞代替电转化，质量影响巨大。

       3) All-Direct方法，这个是我们的改进方法，是在invitrogen方法上做了重要改进，保留了其优点（不用PCR扩增，文库保真度高），去除了其需要经过两次重组的缺点，大大提高文库质量。平均长度较invitrogen方法可以提高200bp，库容量可以提高10倍以上。该方法对RNA的要求量和invitrogen方法一样。

9.2. 海科生物提供的酵母双杂文库有哪些产品内容？

       我们提供的文库产品，包含了文库质粒（大于500ug）以及大肠杆菌文库甘油菌。同时可以选择提供转化到酵母细胞的文库甘油菌，我们会提供100只转化到酵母细胞的文库甘油菌，可以做100次的文库筛选。
       其中文库质粒可以使用共转的方法进行文库筛选，酵母细胞文库甘油菌可以使用maiting的方法进行文库筛选，根据老师的实验习惯可以自由选择，结果没有任何差异的。

9.3. 如何检测文库质量？

       对于文库的质量，一个简单的金标准就是，样本内的所有基因都在文库里，且基因要有一半以上的全长基因，这个文库就是合格的。
       对于文库的检测，可以针对我们交付的产品，做以下几个方面的检测：
       根据老师的样本信息，选择3-5个低拷贝的基因，设计合成引物，以我们提供的文库质粒为模板，进行PCR扩增，如果低拷贝的基因都能扩增出来，高拷贝的就不会丢失，文库质量即可以判断为合格。
        对于我们提供的大肠杆菌文库甘油菌，可以进行梯度稀释后铺板培养，第二天计算库容量，同时挑取单克隆进行PCR扩增和测序检测，以判断插入片段长度和空载率。

9.4. 如何评价文库质量？

       文库质量的关键指标，主要是文库库容、空载率及插入片段平均长度。
       文库的原始库容肯定是越高越好，我们公司承诺的是大于1*10^7的库容量，这个是原始库容量，也就是没有经过任何扩增过程，直接转化出来的库容量。比其他公司承诺的1*10^6的库容量要高10倍以上，下面详细解释下库容量的高低对文库质量的影响:
       生物样本，除了低等生物，目前研究比较多的物种，比如人，大鼠，小鼠，其基因数在5*10^4左右，文库至少得100倍覆盖，也就是库容至少需要5*10^6以上。
       对于植物样本，其基因数量比人的大很多，比如水稻样本，其基因数量为人的2-3倍，小麦样本，其基因数量为人的5-6倍，这样就需要更多的文库库容量。对于水稻样本，需要覆盖100倍的基因数，要求的文库原始库容量是大于1*10^7以上。市场上别的公司提供的文库只能覆盖10倍左右，这么低的覆盖度，必然造成大量基因的丢失。
       对于有的公司宣传的，库容量不是越高越好，这是不负责任的忽悠，为自己的文库质量不合格找不合理的借口。
       对于插入基因长度，别的公司一般平均长度就在800bp左右，我们公司可以承诺做到1200bp以上，这个差距是巨大的，下面再详细介绍下插入片段长度对文库质量的影响：
      一般的一个功能基因，其一般长度会在200个氨基酸以上，也就是编码区在600bp碱基以上，装入文库的基因，除了编码区，还会有5’UTR区，3‘UTR区以及polyA区域，这几个部分加起来，基因的长度一般至少会在1000bp以上。由于文库是个混合物，会存在竞争性抑制，短的基因过多，势必会影响长度基因的比例，以及长的基因的表达丰度。
       我们的文库产品，插入片段平均长度会在1200bp以上，短的会在1000bp左右。对于文库筛选，不是说只要有基因的一个片段就可以了，蛋白质的功能需要多种因素的参与，如果插入基因过短，筛选到的结果只是一个基因片段，甚至是靠近polyA的一小段基因，这个结果的可行度在哪里？基本都可以认为是假阳性的结果的。
       对于有些公司宣称的，文库的基因插入片段不是越长越好，其实是对客户的极其不负责任和不合理的忽悠，只是因为自己没有技术做到更长的片段长度，而找的理由。

9.5. Mating和共转两种筛库方法哪种好？

       共转和maiting两种方法，结果是一样的，只是一个文库质粒转到酵母细胞的方法，对于后续的文库筛选没有区别的，可以根据老师的实验习惯，自由选择的。

9.6 公司文库构建和筛选经验有多久？

       本公司从事各类文库构建和筛选长达10多年，特别是酵母文库，是国内一直完全自己做文库构建和筛选的公司。不像有的公司宣称有10多年文库构建经验，实际上真实情况是其invitrogen系统的文库构建经验只有2-3年，2-3年前其所有的invitrogen系统文库都是外包给某公司做的，只是个二道贩子而已，由于自己一直做不好，才不得不一直外包。文库构建和筛选，经验很重要，长的经验积累，可以保证产品质量和稳定性，一次成功率等。

十、客户文章示例