酵母双杂交文库筛选：
 
一、核蛋白酵母双杂交文库筛选技术服务（可以选择使用invitrogen的pDEST22和clonetech的pGADT7两套系统进行筛选，可以使用预制商业化文库或者本公司定制构建的酵母杂交文库）

1.实验原理

    蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用对真核基因转录调控影响的实验。很早就已知道，转录活化蛋白可以和DNA上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。这种DNA 结合与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两个相互独立的结构域即DNA 结合结构域(BindingDomain, BD)和转录活化结构域(Activation Domain,AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的。目前酵母双杂交实验采用的系统有LexA系统和Gal4系统两种。在LexA系统中，DNA结合结构域由一个完整的原核蛋白LexA构成，转录活化结构域则由一个88个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录; 在Gal4系统中，BD和AD分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域(1-147aa与768-881aa)构成。在利用GAL4系统筛选cDNA文库或研究蛋白间的相互作用时，DNA结合结构域与靶蛋白即"诱饵"相结合，转录活化结构域与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。一般情况下，单独的BD可以与GAL4上游活化序列（GALUAS）结合但不能引起转录，单独的AD则不能与GALUAS结合，只有当BD与AD分别表达的融合蛋白由于相互作用而导致两者在空间上相互靠近时，BD与AD才能与GALUAS结合并且引起报道基因的转录。在BD与AD要导入的酵母菌AH109中，通过基因工程的方法在GAL4 UASs和启动子的下游构建了3个报道基因--ADE2，HIS3，MEL1（或LacZ），因此可以通过营养缺陷筛选和酵母菌表型的改变来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用。GAL4系统的原理如图所示

酵母双杂交系统工作原理

2．系统特点

   同以往研究蛋白质-蛋白质之间相互作用的实验手段相比，双杂交系统具有其独特优势。首先，融合体蛋白之间的相互作用是在真核酵母细胞内进行，蛋白质有可能保持天然的折叠状态，类似其在体内生理状态下的情况，这是其他离体生化检验方法所缺乏的，因此较之后者，它所证实的蛋白质间相互作用将更接近于在体的真实水平。其次，双杂交系统的敏感度即高，可以检测到在蛋白质之间结合常数低至1mmol/L 左右的微弱作用。许多微弱或短暂的蛋白质之间的相互作用可以借助报道基因表达过程中的多级放大效应反映出来；融合蛋白基因在强启动子的作用下，处于较高的表达水平。第三，在筛选cDNA 文库时，双杂交系统能够简捷地得到编码相互作用蛋白的基因序列，它只需构建质粒而不必准备抗体或纯化蛋白，省略了其它体外检测蛋白之间相互作用方法所必须的蛋白抽提、纯化等繁琐步骤。 
    需要指出的是，融合体蛋白必须转运至核内才能活化转录，因此对于胞外配体-受体作用以及需要核外修饰或受磷酸化等翻译后修饰过程介导的蛋白质间相互作用而言，该系统的应用受到一些限制。在进行文库筛选时，假阳性结果常常干扰实验的准确性，除某些文库编码的蛋白质本身含有转录活化成分外，细胞内的其它无关蛋白也可能有类似作用，因此双杂交系统检测的结果必须通过其它蛋白间相互作用的实验来进一步验证。

3. 我们的工作内容

    您只需提供用于筛选的诱饵质粒信息，我们会完成整个的筛选工作，主要包括以下内容：
3.1 诱饵载体的构建
3.2 诱饵质粒的自激活检测
3.3 文库质粒和诱饵质粒共转酵母感受态细胞
3.4 文库筛选和3AT优化
3.5 文库筛选结果测序分析
3.6 筛选结果回转验证
3.7 详细报告的整理和数据发送

4.交付结果

提供详细的、完整的实验报告，清晰的实验图片，筛选结果的测序结果，质粒等。

5.服务报价

3 万元整，现9折促销，即：2.7万元。

6.服务周期

80个工作日

二、膜蛋白酵母双杂交文库筛选技术服务（使用DUALmembrane 技术系统）

1. DUALmembrane 技术原理

    DUALmembrane 技术在传统的酵母双杂交系统的基础上，巧妙地利用分离的泛 素系统（split-ubiquitin）进行跨膜蛋白相互作用的筛选。

    分离的泛素系统（split-ubiquitin） 泛素可以人为分成两部分：N 端（Nub），C 端（Cub）。

    正常情况下，Nub 和 Cub 仍具 有很高的亲合力，表现出野生型 泛素的功能，即仍发挥降解蛋白 质的信号功能。

   那么如何将泛素系统和酵母双杂交融合成一体呢？

   首先，人为地将泛素 Nub 的 3 位异亮氨酸突变为甘氨酸（NubI 突变为 NubG）。 这样与 Cub 的亲合力大大降低，避免了 Cub 和 Nub 自我结合或接近的可能性；。

   其次，将 Cub 部分与人工合成的 LexA-VP16 转录激活因子融合成一个融合蛋白Cub-LexA-VP16。因此正常条件下 NubG 不与 Cub 结合，UBPs 也不能识别分离的泛素，转录激 活因子也不会被切下来。最后，将要检测的蛋白质分别与 NubG 和 Cub 融合，形成 bait 融合蛋白（bait-cub-LexA-VP16）和 prey 融合蛋白（prey-NubG）。如果 bait 和 prey 发 生相互作用，就会促使 NubG 和 Cub 的相互接近，从而得到重构，被 UBPs 识 别，导致 LexA-VP16 的解离，进入核内，从而激活报告基因的转录。

2．系统特点

  可以筛选跨膜蛋白间的相互作用，消除酵母双杂交系统的一些缺陷。

3. 我们的工作内容

   您只需提供用于筛选的诱饵质粒信息，我们会完成整个的筛选工作，主要包括以下内容：
3.1 诱饵载体的构建
3.2 诱饵质粒的自激活检测
3.3 文库质粒和诱饵质粒共转酵母感受态细胞
3.4 文库筛选和3AT优化
3.5 文库筛选结果测序分析
3.6 筛选结果回转验证
3.7 详细报告的整理和数据发送

4.交付结果

提供详细的、完整的实验报告，清晰的实验图片，筛选结果的测序结果，质粒等。

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