酵母三杂交文库筛选：

1.实验原理

与酵母双杂交系统相同，三杂交系统也是利用转录激活子调控真核基因转录的特点，许多转录激活子由结构上可分而功能上独立的两个结构域组成。如酵母Gal4转录激活子包括DNA结合域（DNA binding domain，DNA-BD）和转录激活域（activation domain，AD）。将DNA-BD与诱饵蛋白X融合，AD与靶蛋白Y融合，分别构建BD-X和AD-Y重组质粒载体，并在酵母细胞中共表达。如果诱饵蛋白X与靶蛋白Y相互作用，DNA-BD和AD相互靠近，重组成有活性的Gal4转录激活子，DNA-BD与上游激活序列（UAS）结合，而AD则激活下游报告基因（如lacZ或HIS3）的转录。通过检测β-半乳糖苷酶活性可确定LacZ基因的表达水平。此外，HIS3编码咪唑甘油磷酸脱氢酶（His3p），能使酵母在组氨酸缺陷培养基上生长。3-氨基-1,2,4三唑（3-AT）是His3p的竞争性抑制剂，His3p表达水平高的细胞能在含有较高3-AT浓度的培养基上生长，因此，酵母细胞对3-AT的抑制水平体现了蛋白-蛋白相互作用的强度。

 图1 蛋白三杂交系统

Fig. 1 protein-dependent three-hybrid system

与酵母双杂交系统不同，三杂交是研究两个蛋白和第三个成分间的相互作用，通过第三个分子使两个杂合蛋白相互靠近。第三个成分不同，可以是蛋白、RNA或小分子。在以蛋白为基础的三杂交系统中，蛋白X与Y的稳定相互作用依赖于蛋白Z的存在，Z介导相互作用或诱导一个蛋白的构象改变（如X），从而促进与另一个蛋白Y的相互作用（图1）。在以RNA为基础的三杂交系统中，DNA结合域（LexA BD或Gal4 BD）与RNA结合蛋白（如MS2-外壳蛋白或Hiv-1 RevM10）融合成第一个杂合蛋白，转录激活域（Gal4 AD）与感兴趣的RNA结合蛋白Y融合成第二个杂合蛋白。第三个杂合RNA分子包含与第一个RNA结合蛋白（MS2或RRE）结合的位点（RNA）以及与RNA结合蛋白Y结合的位点X。蛋白Y与RNA结合位点X结合形成具功能的转录激活子（图2）。在小分子三杂交系统中，第三个杂合分子为异源二聚化的小分子复合物（如Dex–FK506，DeX-Mtx），使BD-X与AD-Y融合蛋白相互靠近，重新组成具有功能的转录激活子（图3）。在SenGupta等[1] 最早提出的三杂交系统中，第一个杂合蛋白LexABD-MS2由酵母的L-40膜蛋白编码，第二个杂合蛋白Gal4AD-Y由质粒表达，杂合RNA 分子由RNA聚合酶Ⅲ产生，包括RNAse P 5′前导序列和3′尾随序列（位于mRNA终止密码子后）。RNA聚合酶Ⅲ含有一段由4个或多个T残基形成的转录终止子，而许多RNA 结合蛋白识别富含U的RNA靶标，不能被RNA聚合酶Ⅲ转录。Putz等[2]利用RNA聚合酶Ⅱ转录RNA杂合分子，从而避免富含U的靶RNAs成熟前的转录终止。

                                                  图2 RNA介导的三杂交系统                                      图3 小分子三杂交系统

                                Fig.2  RNA-dependent three-hybrid system            Fig.3 Small molecule three-hybrid system

2. 我们的工作内容

    您只需提供用于筛选的诱饵质粒信息，我们会完成整个的筛选工作，主要包括以下内容：
2.1 诱饵载体的构建
2.2 诱饵质粒的自激活检测
2.3 文库质粒和诱饵质粒共转酵母感受态细胞
2.4 文库筛选和3AT优化
2.5 文库筛选结果测序分析
2.6 筛选结果回转验证
2.7 详细报告的整理和数据发送

3.交付结果

提供详细的、完整的实验报告，清晰的实验图片，筛选结果的测序结果，质粒等。

4.服务报价

询价

5.服务周期

80个工作日