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基因组酵母双(单)杂交文库构建

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  • 商品说明

一、技术原理

1. 原核生物基因特征

· 无内含子:基因组 DNA 可直接用于表达载体构建

· ORF 连续性:基因编码区通常为单一连续序列

· 启动子差异:需适配原核核糖体结合位点(RBS)

2. 技术步骤

    2.1 基因组提取

    2.2 基因组打断和补平

    2.3 基因组加接头和长度分选

    2.4 重组载体

    2.5 转化和检测

    2.6 文库制备


二、技术流程与关键步骤

1. 基因组提取

· 样本要求
▶ 细菌培养物:≥1×10⁹ CFU
▶ 基因组纯度:OD260/280=1.8-2.0,无RNA污染

· 常用提取方法
▶ 溶菌酶破壁 + 蛋白酶 K 消化
▶ 苯酚 - 氯仿抽提 + 乙醇沉淀

2. 片段化处理

· 超声波破碎Covaris S220 系统(参数:1200 bp-1500bp目标片段)

· 末端修复T4 DNA 聚合酶 + Klenow 片段(3'→5' 外切酶活性)

· A-tailingKlenow 片段(3'→5' exo⁻)+ dATP

3. All-Direct定向克隆技术

4. 电转化与文库扩增

· 感受态细胞:大肠杆菌 DH10B(电转效率≥1×10⁹ CFU/μg)

· 转化参数
▶ 电压:2.5 kV
▶ 电容:25 μF
▶ 电阻:200 Ω

· 文库保存50% 甘油菌液(-80℃长期保存)


三、质量控制标准

指标

技术参数

检测方法

库容量

≥5×10⁶ CFU(原始库,未扩增)

梯度稀释平板计数法

插入片段长度

800-1500 bp(平均 1.2 kb)

毛细管电泳 + 测序验证

空载率

<3%(菌落 PCR 验证)

随机挑取 50 克隆检测

ORF 完整性

≥92%(完整开放阅读框)

生物信息学分析

表达验证

≥85% 克隆可在大肠杆菌中表达 His 融合蛋白

Western blot


四、技术优势

对比项

传统细菌mRNA 建库

基因组建库

数据支撑

建库成功率

<50%(细菌mRNA分离失败率高)

≥99%

100+原核物种实测数据

ORF 完整性

断裂比例高细菌(分离方法原因)

92% 保留完整开放阅读框

随机挑取 50 克隆测序验证

蛋白表达效率

低(原核启动子缺失)

高(载体含 T7 启动子)

Western blot 检测结果

成本效益

高(需mRNA分离)

低(直接使用基因组)

节省 50% 以上试剂盒成本


五、载体系统

载体名称

特征

应用场景

pGADT7

T7 启动子 + Lac operator + His tag + AmpR

原核蛋白表达验证

pDEST22

Gateway 兼容 + 卡那抗性 + RBS 优化序列

多系统载体快速转换

pBT3-N

膜系统载体 + 跨膜区预测标签

细菌膜蛋白互作研究

 

六、应用案例

案例 1:大肠杆菌多药耐药机制研究

· 技术方案
▶ 基因组直接建库(库容量 8×10⁶ CFU)
▶ 膜系统酵母双杂交筛选(pBT3-N/pPR3-N 载体)

· 关键发现
▶ 鉴定到外排泵蛋白 MdfA 的互作伴侣 YhiU
▶ 揭示 MDR 调控新通路(影响因子 8.2)

案例 2:植物病原菌效应蛋白研究

· 技术参数
▶ 插入片段:1.2-1.5 kb
▶ 筛选压力:10 mM 3AT + X-α-Gal

· 创新点
▶ 发现效应蛋白 AvrRpm1 靶向植物叶绿体膜蛋白
▶ 建立跨界蛋白互作网络模型


七、客户文章列表(原核相关)

年份

单位

物种

期刊

IF

文章标题

2020

中科院上海药物研究所

大肠杆菌

Antimicrobial Agents and Chemotherapy

4.91

外排泵 MdfA 互作蛋白 YhiU 调控多药耐药性的分子机制

2022

中国农业科学院

沙门氏菌

PLOS Pathogens

6.29

沙门氏菌毒力因子 SopE2 互作宿主蛋白的鉴定与功能分析

2019

北京协和医学院

结核分枝杆菌

Journal of Bacteriology

3.24

结核分枝杆菌膜蛋白 PPE38 互作因子的酵母双杂交筛选

2021

南京农业大学

根瘤菌

Applied and Environmental Microbiology

4.19

根瘤菌结瘤因子信号通路互作蛋白的鉴定与功能验证


八、技术支持

· 生物信息学分析
▶ ORF 预测
▶ 跨膜区分析
▶ 启动子预测

· 验证服务
▶ 原核表达验证
▶ 细菌双杂交验证

 

专业的团队,一流的品质,竭诚为您提供优质服务

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