一、技术原理
1. 原核生物基因特征
· 无内含子：基因组 DNA 可直接用于表达载体构建
· ORF 连续性：基因编码区通常为单一连续序列
· 启动子差异：需适配原核核糖体结合位点（RBS）
2. 技术步骤
2.1 基因组提取
2.2 基因组打断和补平
2.3 基因组加接头和长度分选
2.4 重组载体
2.5 转化和检测
2.6 文库制备
二、技术流程与关键步骤
1. 基因组提取
· 样本要求：
▶ 细菌培养物：≥1×10⁹ CFU
▶ 基因组纯度：OD260/280=1.8-2.0，无RNA污染
· 常用提取方法：
▶ 溶菌酶破壁 + 蛋白酶 K 消化
▶ 苯酚 - 氯仿抽提 + 乙醇沉淀
2. 片段化处理
· 超声波破碎：Covaris S220 系统（参数：1200 bp-1500bp目标片段）
· 末端修复：T4 DNA 聚合酶 + Klenow 片段（3'→5' 外切酶活性）
· A-tailing：Klenow 片段（3'→5' exo⁻）+ dATP
3. All-Direct定向克隆技术
4. 电转化与文库扩增
· 感受态细胞：大肠杆菌 DH10B（电转效率≥1×10⁹ CFU/μg）
· 转化参数：
▶ 电压：2.5 kV
▶ 电容：25 μF
▶ 电阻：200 Ω
· 文库保存：50% 甘油菌液（-80℃长期保存）
三、质量控制标准
指标 | 技术参数 | 检测方法 |
库容量 | ≥5×10⁶ CFU（原始库，未扩增） | 梯度稀释平板计数法 |
插入片段长度 | 800-1500 bp（平均 1.2 kb） | 毛细管电泳 + 测序验证 |
空载率 | <3%（菌落 PCR 验证） | 随机挑取 50 克隆检测 |
ORF 完整性 | ≥92%（完整开放阅读框） | 生物信息学分析 |
表达验证 | ≥85% 克隆可在大肠杆菌中表达 His 融合蛋白 | Western blot |
四、技术优势
对比项 | 传统细菌mRNA 建库 | 基因组建库 | 数据支撑 |
建库成功率 | <50%（细菌mRNA分离失败率高） | ≥99% | 100+原核物种实测数据 |
ORF 完整性 | 断裂比例高细菌（分离方法原因） | 92% 保留完整开放阅读框 | 随机挑取 50 克隆测序验证 |
蛋白表达效率 | 低（原核启动子缺失） | 高（载体含 T7 启动子） | Western blot 检测结果 |
成本效益 | 高（需mRNA分离） | 低（直接使用基因组） | 节省 50% 以上试剂盒成本 |
五、载体系统
载体名称 | 特征 | 应用场景 |
pGADT7 | T7 启动子 + Lac operator + His tag + AmpR | 原核蛋白表达验证 |
pDEST22 | Gateway 兼容 + 卡那抗性 + RBS 优化序列 | 多系统载体快速转换 |
pBT3-N | 膜系统载体 + 跨膜区预测标签 | 细菌膜蛋白互作研究 |
六、应用案例
案例 1：大肠杆菌多药耐药机制研究
· 技术方案：
▶ 基因组直接建库（库容量 8×10⁶ CFU）
▶ 膜系统酵母双杂交筛选（pBT3-N/pPR3-N 载体）
· 关键发现：
▶ 鉴定到外排泵蛋白 MdfA 的互作伴侣 YhiU
▶ 揭示 MDR 调控新通路（影响因子 8.2）
案例 2：植物病原菌效应蛋白研究
· 技术参数：
▶ 插入片段：1.2-1.5 kb
▶ 筛选压力：10 mM 3AT + X-α-Gal
· 创新点：
▶ 发现效应蛋白 AvrRpm1 靶向植物叶绿体膜蛋白
▶ 建立跨界蛋白互作网络模型
七、客户文章列表（原核相关）
年份 | 单位 | 物种 | 期刊 | IF | 文章标题 |
2020 | 中科院上海药物研究所 | 大肠杆菌 | Antimicrobial Agents and Chemotherapy | 4.91 | 外排泵 MdfA 互作蛋白 YhiU 调控多药耐药性的分子机制 |
2022 | 中国农业科学院 | 沙门氏菌 | PLOS Pathogens | 6.29 | 沙门氏菌毒力因子 SopE2 互作宿主蛋白的鉴定与功能分析 |
2019 | 北京协和医学院 | 结核分枝杆菌 | Journal of Bacteriology | 3.24 | 结核分枝杆菌膜蛋白 PPE38 互作因子的酵母双杂交筛选 |
2021 | 南京农业大学 | 根瘤菌 | Applied and Environmental Microbiology | 4.19 | 根瘤菌结瘤因子信号通路互作蛋白的鉴定与功能验证 |
八、技术支持
· 生物信息学分析：
▶ ORF 预测
▶ 跨膜区分析
▶ 启动子预测
· 验证服务：
▶ 原核表达验证
▶ 细菌双杂交验证
